Jacob蛋白在活性依赖突触可塑性的突触—核信号传递过程中的作用研究

【摘要】第一部分Jacob蛋白的过量表达在突触-核信号传递中的作用研究背景：一般认为,突触-核信号传递在长时程记忆模式中起着很重要的作用。但是,突触信号传递中活性依赖的基因表达调控过程仍然不清楚。近年来,发现了少数潜在的突触-核信号蛋白,这类蛋白在活性依赖的突触可塑性诱导之后发生活性依赖的胞核输入过程并且参与基因表达调控过程。但是,令人惊讶的是,这类蛋白在活性依赖的突触可塑性诱发后,其胞核输入过程缺乏能用肉眼观察到的证据。近来仅发现了转录因子环化单磷酸腺苷应答元件结合蛋白2(CREB2)在原代海马细胞突触传递的LTD过程中转运进核,而不是在原代海马细胞突触传递的LTP过程中发生转运进核。Jacob是另外一种能与NMDA受体偶联引起核基因表达过程的信号蛋白。因此,我们的目的是研究在活性依赖的突触可塑性的生理有关模型中Jacob是否在胞核内累积。方法及主要结果：我们分析了在海马脑片的Schaffercollateral-CA1的突触进行NMDA受体依赖的LTP和LTD诱导之后Jacob的胞核输入动态过程。用Time-lapse扫描表达了Jacob-绿色荧光融合蛋白的神经元,我们发现Jacob在LTP的强直刺激下而不是在LTD的诱导后迅速地从树突定位到核内。免疫化学染色证实了相较于近胞体端树突,在LTP而非LTD诱导后内源性Jacob在胞核中累积。更进一步的实验中,我们分别对wild-typeJacob(完整序列)表达的海马脑片上的LTP结果和Delta-NLS-Jacob(没有核定位信号)表达的海马脑片上的LTP结果进行了分析。采用Semliki森林病毒(SFV)转染海马CA1区神经元,我们观察到,只有过量表达Delta-NLSJacob的海马脑片上的兴奋性突触后场电位slope记录值增强了,而且Delta-NLSJacob的过量表达对LTP的增强作用是通过NR2B受体介导的。而wild-typeJacob的过量表达并没有改变LTP。另外,我们分析了电生理LTP诱导后的wistar大鼠海马脑片上的CA1区神经元核蛋白的westernblot的实验数据。Westernblot结果显示Jacob蛋白是在LTP的维持过程中而不是在LTP诱导后立即发生胞核内磷酸化。结论和意义：总之,实验结果显示NMDA受体依赖的突触可塑性的两种主要表现形式LTP和LTD,对引起Jacob的核定位结果有所不同,而且LTP引起的Jacob核定位需要NR2B受体的激活。而过量表达的wildtypeJacob不改变LTP,这一点也许提示着wildtypeJacob在内源性蛋白水平充足的情况下可能干扰可塑性相关过程。这些研究表明Jacob参与了海马中活性依赖的突触可塑性形成的相关机制。第二部分Jacob和Caldendrin的基因敲除在突触传递可塑性中的功能分析背景：NMDA(N-甲基-D-天冬氨酸)受体和钙在神经元内可以发挥多种不同的作用,从而影响突触可塑性,神经元变性,细胞死亡等等。Caldendrin是一种神经元Ca2+感受器,一种与钙调蛋白具有高度相似性的突触后密度成分。而Jacob近来被确定为Caldendrin结合蛋白,是一种在边缘脑和大脑皮质大量表达的新蛋白。Caldendrin结合Jacob的核定位信号是以一种Ca2+依赖的方式进行。Jacob的胞核输入过程严格地取决于NMDA受体的激活。方法和实验结果：我们前面的工作表明了Jacob的核定位过程是在：1)NMDA受体激活后；2)通过电刺激Schaffer-collateralCA1的突触来诱导突触可塑性后进行的。但是,依然存在的问题是,这种活性依赖的定位过程是否是突触传递增强必需的呢?为了解决这个问题,从基因敲除(Jacob没有表达或者Caldendrin没有表达)的小鼠上获得的急性海马脑片被用来检测并分析突触可塑性以及海马的基础突触传递。长时程增强(LTP)和长时程抑制(LTD)是NMDA受体依赖的突触可塑性的两种主要表现形式。采用CRE+FloxJacobmicestrain(Jacobknockout)和Caldendrinknockoutmicestrain(CaBP1KO)两种小鼠进行实验,我们发现Jacobknockout和Caldendrinknockout对LTP有着类似的影响但是对LTD却有着不同的影响。与wildtype小鼠相比,Jacobknockout小鼠表现为突触传递效能不足,这表明Jacob参与了活性依赖的突触增强过程。实验发现,即使在LTD诱导后没有检测到Jacob的核定位过程,Jacobknockout的实验表明了Jacob参与了活性依赖的突触长时程抑制过程。然而PPF(双脉冲易化)没有改变,这提示着Jacob对突触前膜囊泡释放没有影响。免疫组织化学染色实验证实了在LTP诱导后,wild-type海马脑片CA1神经元核内磷酸化的环化单磷酸腺苷(pCREB)增加了,而Jacobknockout海马脑片CA1神经元核内磷酸化的环化单磷酸腺苷(pCREB)降低了。与wildtype小鼠相比,Caldendrinknockout小鼠在LTP上也表现为突触传递效能不足,而在LTD上表现为突触传递效能的增加,这提示着Caldendrin参与活化依赖性突触增强和抑制。结论和意义：这些实验也许提示着没有Caldendrin与Jacob的核定位信号进行结合,即使NMDA受体被激活,LTP也不能维持。这使得Caldendrin-Jacob结合的复合体在海马突触可塑性表达中的功能作用被更深入地理解。
【作者】袁向平安；
【导师】ThomasBehnisch；
【作者基本信息】复旦大学，神经生物学，2012，博士
【关键词】突触-核信号传递；长时程增强(LTP)；长时程抑制(LTD)；N-甲基-天冬氨酸受体；环化单磷酸腺苷应答元件结合蛋白(CREB)；Semliki森林病毒(SFV)；Ca2+感受器；海马；核定位信号；基础突触传递；磷酸化的环化单磷酸；腺苷；Caldendrin-Jacob结合的复合体；

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